circRNA翻译是非常受关注的研究思路，近几年已经有十余篇研究报道。近日，一项发表在《Molecular Cancer》（IF=10.679）的来自中山大学附属第三医院郑俊和张磊，悉尼大学Storr肝病研究中心乔梁教授的一项circRNA翻译蛋白的研究工作，该研究报道结肠癌中circFNDC3B编码蛋白可以抑制Snai1表达并抑制EMT和肿瘤进展！
结肠癌中circFNDC3B的发现和鉴定
图1 结肠癌中circFNDC3B的发现和鉴定
circFNDC3B抑制细胞增殖和迁移侵袭
图2 circFNDC3B抑制细胞增殖和迁移侵袭
circFND3B编码蛋白鉴定
序列分析表明circFNDC3B存在一个大于一圈的ORF。circFNDC3B长度526nt，这个一圈多的ORF总长度657nt，预测的蛋白序列有218aa。序列比对的结果显示这个218aa的序列的N端有一段不同于FNDC3B母基因蛋白的独有序列。ORF的上游有一段序列可能有IRES的功能，荧光素酶报告基因的验证证明了这一段的确具有IRES功能。
为验证circFNDC3B的翻译产物，作者构建了四个载体进行验证分析：
（1）Lv-vector：慢病毒空载体。
（2）Lv-circFNDC3B-flag：将Flag序列融合至预测ORF中。融合位置为ORF的中间，避免了这种ORF占了一圈多的情况下在N端或C端融合导致的插入Flag序列对ORF的改变过大的问题。本文的Flag融合位置设计在93位氨基酸后面，该位置避开了ORF终止密码子的位置（circFNDC3B-218aa的终止密码子与91和92位的氨基酸有序列交叠）。
（3）Lv-circFNDC3B-flag-mut：Flag序列融合至ORF中，但其实密码子突变为ACG。
（4）Lv-circFNDC3B-218aa：直接表达线性的circFNDC3B-218aa ORF，C端融合Flag序列。
四种病毒载体感染细胞后，有circFNDC3B的载体显著增加了circRNA的表达水平，但所有的载体对FNDC3B母基因的影响都非常低。WB实验验证了circFNDC3B-218aa的翻译产物，用了两种抗体检测：一个是anti-Flag的抗体，验证了融合Flag后的circFNDC3B-218aa表达，起始密码子突变后这个条带消失。另一个是anti-FNDC3B的一种商业化抗体，也可以识别circFNDC3B-218aa，这种商业化抗体也检测到了Flag融合后的蛋白条带，同时在病毒载体表达产物不能准确翻译circFNDC3B-218aa的两组中也有很弱的条带出现，可能是细胞内源circFNDC3B-218aa产物的条带。最后，作者从IP产物的蛋白质谱中找到了具有circFNDC3B-218aa特有氨基酸序列的蛋白质谱峰。
图3 circFNDC3B编码蛋白鉴定
circFNDC3B功能机制研究
图4 circFNDC3B编码蛋白而非RNA发挥功能
图5 circFNDC3B-218aa体内抑制肿瘤生长
参考文献：
1. Pan, Z., et al., A novel protein encoded by circFNDC3B inhibits tumor progression and EMT through regulating Snail in colon cancer. Mol Cancer. 2020.
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Molecular Cancer | circFNDC3B编码蛋白可抑制结肠癌！
发布时间：2020-04-13 11:14 文章来源：未知 作者：凯发k8国际首页登录
结肠癌中circFNDC3B的发现和鉴定
图1 结肠癌中circFNDC3B的发现和鉴定
circFNDC3B抑制细胞增殖和迁移侵袭
图2 circFNDC3B抑制细胞增殖和迁移侵袭
circFND3B编码蛋白鉴定
序列分析表明circFNDC3B存在一个大于一圈的ORF。circFNDC3B长度526nt，这个一圈多的ORF总长度657nt，预测的蛋白序列有218aa。序列比对的结果显示这个218aa的序列的N端有一段不同于FNDC3B母基因蛋白的独有序列。ORF的上游有一段序列可能有IRES的功能，荧光素酶报告基因的验证证明了这一段的确具有IRES功能。
为验证circFNDC3B的翻译产物，作者构建了四个载体进行验证分析：
（1）Lv-vector：慢病毒空载体。
（2）Lv-circFNDC3B-flag：将Flag序列融合至预测ORF中。融合位置为ORF的中间，避免了这种ORF占了一圈多的情况下在N端或C端融合导致的插入Flag序列对ORF的改变过大的问题。本文的Flag融合位置设计在93位氨基酸后面，该位置避开了ORF终止密码子的位置（circFNDC3B-218aa的终止密码子与91和92位的氨基酸有序列交叠）。
（3）Lv-circFNDC3B-flag-mut：Flag序列融合至ORF中，但其实密码子突变为ACG。
（4）Lv-circFNDC3B-218aa：直接表达线性的circFNDC3B-218aa ORF，C端融合Flag序列。
四种病毒载体感染细胞后，有circFNDC3B的载体显著增加了circRNA的表达水平，但所有的载体对FNDC3B母基因的影响都非常低。WB实验验证了circFNDC3B-218aa的翻译产物，用了两种抗体检测：一个是anti-Flag的抗体，验证了融合Flag后的circFNDC3B-218aa表达，起始密码子突变后这个条带消失。另一个是anti-FNDC3B的一种商业化抗体，也可以识别circFNDC3B-218aa，这种商业化抗体也检测到了Flag融合后的蛋白条带，同时在病毒载体表达产物不能准确翻译circFNDC3B-218aa的两组中也有很弱的条带出现，可能是细胞内源circFNDC3B-218aa产物的条带。最后，作者从IP产物的蛋白质谱中找到了具有circFNDC3B-218aa特有氨基酸序列的蛋白质谱峰。
图3 circFNDC3B编码蛋白鉴定
circFNDC3B功能机制研究
图4 circFNDC3B编码蛋白而非RNA发挥功能
图5 circFNDC3B-218aa体内抑制肿瘤生长
参考文献：
1. Pan, Z., et al., A novel protein encoded by circFNDC3B inhibits tumor progression and EMT through regulating Snail in colon cancer. Mol Cancer. 2020.